Культура кератиноцитов, в данном случае моих собственных.
Для ЛЛ: Я извлёк образец собственной кожи и стал растить собственные клетки в инкубаторе. Эксперимент получился, но мне удалось извлечь намного меньше клеток, чем я ожидал.
Я не стал ставить тег "жесть", но в публикации есть фотографии как я делаю себе биопсию кожного диска 2 мм в диаметре. Возможно, кому-то это может показаться неприятным.
Не рекомендую пытаться этот эксперимент повторять, даже при наличии соотвествующих материалов и оборудования.
Мы привыкли считать себя индивидуумами, нейронные сети в нашем мозгу дают очень выраженное понятие собственного "Я", что является до некоторой степени иллюзией, но это тема другого долгого рассказа. Наши тела состоят из триллионов довольно независимых наномашин - клеток. В среднем человеческое тело состоит из 37.2 триллинов клеток. Каждая имеет в себе полный геном организма. И массу программ для выполнения различных функций. Клетки могут реагировать на химические и биологические сигналы, перемещаться, самовоспроизводится, обмениваться информацией, посылать различные сигналы, вызывать клетки других типов и многое другое. На самом деле наши клетки довольно независимы и могут прекрасно жить вне нашего тела если обеспечивать им соответствующие условия. Генриета Лакс или точнее клетки её саркомы это гарантируют. Для примера, я возьму биопсию собственной кожи. Я давно хотел купить человеческие кератиноциты, но зачем, ведь источник человеческих кератиноцитов у меня буквально под рукой, это я сам. Кстати, это давно отработанная методика и за исключением, что исследователь использует себя в качестве донорского материала, ничего необычного нет.
В США и ряде других стран доступным источником донорской кожи выступает материал после процедуры обрезания. Я на такие жертвы ради науки идти не готов, так что обойдёмся кожей тыльной части запястья.
Нужно сбрить волосы, теперь обработаем кожу спиртом, бактерии и грибки очень хорошо размножаются в питательной среде, которую я использую для своих клеток, поэтому важна стерильность. Если вырастут грибы или бактерии эксперимент окончится неудачей. Обработка кожи 70% этанолом вполне подойдет.
Теперь возьмём инструмент для биопсии, и сделаем забор 2 мм кожного диска.
Не бойтесь, это не очень больно, в этом районе кожи довольно мало нервных окончаний.
Здесь должна была быть фотография, как я микро ножницами отделял биопсионный диск, нужно было использовать скальпель, но это сложно делать одной рукой. Обе руки были заняты так что сделать фотографию не получилось. Вместо фотографии рассмотрим строение человеческой кожи.
Мне важно не зайти слишком глубоко в дерму иначе останется шрам и рана будет долго заживать. Кроме того, клетки в роговом, блестящем, зернистом и шиповатом, слоях по большей части нежизнеспособны, они на пути к орговению. Чтобы эксперимент получился, мне нужно захватить в образце базальный слой стволовых клеток, которые способны делиться. В дальшейшем, можно видеть что получилось, это лишь частично, всё таки брать у себя биопсию достаточно сложно.
Поместим извлечённый материал в физиологический раствор (PBS). Мне нужно отмыть образец от эритроцитов, ну и занятся собой.
Обычного пластыря от царапин вполне достаточно, рана полностью заживёт за 10-14 дней. Биопсия выполненая нестерильными инструментами или без надлежашего ухода за биопсийной раной, может стать опасным источником инфекции.
Теперь приготовим питательную среду для кожного экспланта я использую Keratinocyte GM2 с пакетом факторов роста, человеческим EGF, инсулином, эпинефрином и ионами кальция. Купить среду можно здесь. Для предотвращения инфекции в культуре добавил 1% смеси пеннициллина и стрептомицина. Если есть опасения, что в образце могут быть споры грибов, можно добавить амфотерицин Б, но он негативно влияет на рост клеток и я его использовать не стал. На GM2 так же хорошо растут клетки эпителия роговицы и есть методика её забора, но во первых такие клетки у меня в культуре есть, во вторых забор образца роговичного эпителия глаза слишком опасно. Как правило, роговичный эпителий выделяется из трупного материала.
Чтобы кожный эксплант было удобно фотографировать и наблюдать я залью его в особый биогель Geltrex он застывает при 37 градусах. Оказалось, что это была не лучшая идея, да фотографировать эксплант было удобно, но хорошего роста клеток не получилось.
Теперь добавим питательную среду и поставим образец в инкубатор.
Рост эндотелиальных клеток и перицитов в 3д кльтуре из экспланта хориоидеи глаза мыши (пятый день в культуре). На мышах у меня всё получается намного лучше.
А это то, что получилось с кожей. Спустя почти неделю, результаты меня не впечатлили, я ожидал роста клеток из экспланта кожи, в биогель, чтобы показать вам 3д культуру, как на картинке из экспланта хориоидеи мыши, но этого не произошло.
Есть несколько моментов которые я, возможно, в этом эксперименте упустил:
1. Не следовало использовать биогель, а позволить экспланту лечь на дно пластика, возможно биогель мешает росту клеток кожи.
2. Я взял образец слишком поверхностно, не захватив достаточно клеток зоны роста. Скорее всего именно это и произошло.
3. Нужно было разрезать образец на фрагменты чтобы улучшить питание образца в культуре. В экспланте нет кровообращения, поэтому питательные вещества и кислород ткань получает напрямую из культуры.
Однако эксперимент не окончился полной неудачей, убрав эксплант я обнаружил на пластике под эксплантом группу здоровых кератиноцтов. Вот они, в фазово-контрастной микроскопии. Это мой самый необычный автопортрет.
Конечно клеток очень мало, учитывая что в экспланте было около 3-4 миллионов клеток, но самое главное, что нет роста фибробластов или других ненужных мне клеток. Теперь кератиноциты быстро размножатся из через несколько недель у меня уже будут миллионы клеток в культуре.
Это очень странное чувство, смотреть как растут твои собственные клетки.
Оставшийся образец я разрезал на 4 части и поместил обратно в культуру. Если там ещё есть живые кератиноциты, они, возможно, вырастут.
В будущем я планирую использовать эти клетки в своих экспериментах. Например с помощью этой культуры можно изучать барьерную функцию (проницаемость кожи для различных веществ).
Я могу заменить участки кожи голых мышей собственными клетками и получить химерное существо. У голых мышей нет активной имунной системы и клетки отторгаться не будут, шерсти у них кстати тоже нет.
Самое интересное, что эта культура клеток имеет полное совпадние HLA маркеров моего тела, в этом нет ничего удивительного, это же мои клетки. Это значит, что клетки могут быть ре-имплантированны обратно в организм и не будут отторгаться. Например, я могу делать себе клеточную терапию ран или ожогов, достаточно заполнить свежую рану клеточной массой и заклеить пластырем. Более того, я могу модифицировать ДНК собственных клеток например внедрить в их ДНК ген медузы Aequorea victoria кодирующий зелёный флоуресцентный белок GFP, а затем точечно ввести под кожу обратно, получится биологическая татуировка, которая будет светится зелёным в УФ и синем свете.
В общем интересных применений много.
