Вы когда-нибудь задумывались, как хищные растения, не имея ни нервов, ни мышц, могут молниеносно захлопывать свои ловушки, когда на них садится насекомое? За молекулярные основы этого процесса взялся поистине звездный состав исследователей: группы Ардема Патапутиана, специалиста по механочувствительным ионным каналам и нобелиата 2021 года, и Джоан Чори – одной из самых влиятельных физиологов растений нашего времени. Их статью, опубликованную в прошлом году в журнале eLife (Procko et al., 2021), мы разберем в этой заметке.
Joann Chory, SALK INSTITUTE 2019
Большинство растений способны изменять свой рост в ответ на механические стимулы – гравитацию или изменения тургорного давления. Рост, конечно, происходит медленно. Но у некоторых растений в процессе эволюции возникли механизмы быстрых ответов на прикосновение – чтобы не быть съеденным травоядными животными, как, например, у мимозы стыдливой, или, наоборот, чтобы поедать самих животных, как это делают хищные растения. Венерина мухоловка растет на бедных почвах, и ее предки «научились» получать биогенные элементы, в первую очередь азот, из насекомых.
Так уж вышло, что для большинства движений живых организмов совершенно необходимо изменение мембранного потенциала – разности электрических потенциалов на внешней мембране клетки, возникающей из-за разницы концентраций различных заряженных частиц – ионов. Например, для сокращения мышц у человека нужно, чтобы ионы кальция, вошедшие в мышечную клетку, связались с сократительными белковыми нитями и запустили их скольжение друг относительно друга. Мембранный потенциал может меняться, если в мембране откроются каналы, пропускающие какой-то тип ионов. Почему они открываются? Стимулом для открытия каналов могут быть изменения мембранного потенциала (так получаются петли обратной связи), действие сигнальных молекул на мембранные рецепторы, температура или механические стимулы. Так мы приходим к идее механочувствительных ионных каналов. Выяснилось, что белки, образующие механочувстительные каналы, закодированы в геномах самых разных живых организмов – от кишечной палочки до арабидопсиса и человека. Они делятся на несколько семейств разного происхождения.
Ловушка венериной мухоловки закрывается в ответ на прикосновение за 100 миллисекунд. Поэтому гипотеза о том, что цепочка сигналов, вызывающих ее движение, начинается с механочувствительных каналов, кажется вполне разумной.
Захлопывание ловушки венериной мухоловки, видео из обсуждаемой статьи.
Как именно происходит закрытие ловушки? На видоизмененных листьях, которые образуют ловушку, есть по три или четыре механочувствительных волоска. Изгиб одного волоска вызывает вход ионов кальция и потенциал действия (скачок мембранного потенциала), который распространяется по всемй ловушке. Но для ее закрытия требуется смещение еще одного волоска и дополнительная порция кальция – видимо, чтобы снизить вероятность ложных срабатываний. Это было описано уже в 1873 году (полный текст этой статьи 1873 года можно прочитать на сайте журнала, и это две страницы чистого удовольствия Burdon-Sanderson, 1873). Замечу, что в обсуждаемой статье авторы равноценно ссылаются на работы 1873, 1910, 1942, 1970, 2005, 2015 и 2020 годов в одном абзаце. Такую практику цитирования редко встретишь в работах про ионные каналы, и эта преемственность в сочетании с современными методами стала еще одной причиной поделиться этой статьей с читателями.
А. Строение ловушки венериной мухоловки. B. Строение чувствительного волоска: P – основание; In –шейка; L – рычаг. C, D. Гены, экспрессия которых в чувствительных волосках выше, чем в ткани остальной ловушке. Рисунок из обсуждаемой статьи.
В поисках молекул ионных каналов, обеспечивающих закрытие ловушки, авторы решили отсеквенировать РНК в клетках чувствительных волосков, ловушки и обычных листьев, чтобы выяснить, экспрессия каких генов в них отличается. Тут начинаются сложности. Во-первых, для венериной мухоловки нет генетически чистых лабораторных линий, из которых можно было бы раздобыть много материала для анализа. Поэтому авторы прибегли к вегетативному размножению этих растений, чтобы получить генетически идентичный клон. Что, впрочем, не спасает от гетерозиготности этого клона: копии генов, полученные от двух родителей, различаются. Во-вторых, у венериной мухоловки достаточно большой геном, в двадцать раз больше генома стандартного модельного растения резуховидки (она же арабидопсис). В итоге авторы получили 28 тысяч последовательностей матричных РНК, что больше 21 тысячи предсказанных генов, вероятно, в силу альтернативного сплайсинга и аллельных различий.
Среди транскриптов, которые чаще встречались в клетках чувствительных волосков, авторы выделили те, которые кодируют трансмембранные белки, пересекающие мембрану более одного раза. Из 45 кандидатов три оказались гомологичны известным механочувствительным каналам других организмов. Два были родственны бактериальным механочувствительным каналом низкой проводимости MscS и относились к растительному семейству MSL (Msc-S-Like), а третий был гомологичен растительным каналам семейства OSCA. Авторы назвали первые два белка буквально мухоловками – FLYCATCHER1 и FLYCATCHER2 (FLYC1 и FLYC2), а третий DmOSCA, от латинского названия венериной мухоловки Dionaea muscipula.
Ген FLYC1 экспрессировался в чувствительных волосках в 85 раз сильнее, чем в остальной ткани ловушки. Другие два кандидата были для чувствительных волосков гораздо менее специфичны.
Чувствительный волосок состоит из трех элементов: основания, шейки и рычага. FLYC1 экспрессировался именно в тканях шейки, которая и изгибается при прикосновению к волоску, DmOSCA находился в большем количестве в тканях шейки, но также и в других частях чувствительных волосков. А продукт гена FLYC2 авторы не смогли обнаружить с помощью использованного ими метода флуоресцентной гибридизации in situ.
A, C. Окрашивание чувствительного волоска толуидиновым синим. B, D, E Флуоресцентная in situ гибридизация отдельных молекул. Продольный (A, B) и поперечный (С, D, E) срезы. Красная флуоресценция с пробой против FLYC1 наблюдается в тканях шейки (B, верхняя панель, D), но не в тканях рычага (E), и отсутствует в контроле (B, нижняя панель). В контроле и в тканях рычага наблюдается красная аутофлуоресценция клеточных стенок. Рисунок из обсуждаемой статьи.
Затем авторы решили проверить, достаточно ли белка FLYC1 для возниконовения механочувствительного тока в клетках, в которых нет собственных механосенсоров. Для этого авторы взяли культуру человеческих клеток HEK, в которых выключен ген PIEZO1, кодирующий у человека основной механочувствительный канал. Генетический код в первом (да и во втором) приближении одинаков у всех живых организмов, поэтому ничто не мешает клеткам человека производить растительные белки, если вставить растительный ген в подходящий вектор. Однако есть нюанс: предпочтения по эффективности различных кодонов немного различаются в разных группах организмов, поэтому для достаточного уровня экспрессии белка в клетках далекого таксона нужно оптимизировать используемые в нем кодоны. Это еще одна сложность при работе с немодельными организмами, впрочем, довольно легко преодолимая в наше время, когда есть коммерческие сервисы по синтезу генов с любой последовательностью.
Более того, использование такой гетерологичной системы экспрессии (то есть клеток другого организма) значительно усиливает вывод о том, что данный белок и есть искомый канал. Ведь можно представить себе, что этот белок пропускает токи не сам, а помогает в этом какому-то другому белку. Тогда, если взять клетки листа растения и экспрессировать в них белок из того же растения, то может оказаться, что в этих клетках исходно был белок «настоящего канала», который был неактивен без своего партнера, но дает токи в его присутствии. В то время как использование клеток эволюционно очень далекого организма позволяет почти полностью исключить такой сценарий.
Итак, авторы экспрессировали оптимизированную под клетки млекопитающих последовательность FLYC1 и с помощью метода локальной фиксации потенциала (который никто так не называет, а называют patch-clamp) записали токи в ответ на изменение давления в микроэлектроде. Не буду перечислять все характеристики этого тока, кроме того, что этот канал избирательно пропускает ионы хлора. Хлоридные токи удивительны тем, что могут вызывать как деполяризацию (то есть сдвигать мембранный потенциал к более положительным значениям), так и гиперполяризацию (делать мембранный потенциал еще более отрицательным) в зависимости от исходных концентраций хлорида внутри клетки. И в первом случае они могут вызывать открытие потенциалзависимых кальциевых каналов и генерацию потенциалов действия, что и происходит в чувствительных волосках венериной мухоловки.
Для двух оставшихся генов-кандидатов авторы не смогли записать ионные токи в аналогичных условиях, что все же неудивительно: механизмы сворачивания и транспорта белков в клетках растений и животных все же немного отличаются. Возможно также, что порог активации этих каналов слишком высок, и для их активации требуется такое давление в микроэлектроде, какого в эксперименте невозможно достичь: клетку просто «сдует».
Охота росянки, видео из обсуждаемой статьи.
И наконец авторы задались вопросом, насколько консервативна роль белка FLYC1 у хищных растений семейства росянковых. Они взяли капскую росянку, у которой механизм ловли насекомых отличается от такового у венериной мухоловки: на листе росянки есть щупальца с покрытыми слизью головками. Когда насекомое садится на лист, оно прилипает к слизи, а щупальца изгибаются по направлению к центру листа, чтобы еще сильнее связать жертву и заняться ее перевариванием. У росянки авторы нашли два гомолога FLYC1: FLYC1.1 и FLYC1.2. Они экспрессировались во внешних секреторных клетках щупалец. Но, как и в случае с FLYC2 и DmOSCA венериной мухоловки, авторы не смогли записать в культуре клеток токи, вызванные этими белками. Они полагают, что здесь трудность тоже заключается в правильном сворачивании белков в пространстве или их доставке на мембрану. Но тот факт, что эти белки локализуются в «правильных» клетках столь отличного по строению листа росянки, дает основания считать, что белки этого семейства служат механосенсорами и у росянки.
A, B. Лист росянки. C. Экспрессия FLYC1.1 и FLYC1.2 в тканях щупалец относительно ткани листа. D. Строение щупальца росянки: X – ксилема; E – эндодерма; S – секреторные клетки. E. Флуоресцентная. гибридизация in situ показывает экспрессию FLYC1.1/2 в секреторных клетках. Рисунок из обсуждаемой статьи.
Чего бы еще хотелось увидеть? Конечно, выключить эти гены и посмотреть, что получится! Но тут мы опять упираемся в проблемы изучения немодельных организмов: у исследователей просто нет устоявшихся методов для выключения генов в клетках хищных растений. Да, эти методы не должны сильно отличаться от того, как это делается для арабидопсиса, но дьявол в деталях. Хорошая новость заключается в том, что протокол для получения трансгенных мухоловок уже разработали исследователи из Японии (Suda et al., 2020). Так что ждем дальнейших работ по одним из самых удивительных, по словам Чарльза Дарвина, растений на свете.
Наш дзен: https://dzen.ru/id/6309229a98f36728dd8046f0
Текст: #Гурьев@inbioreactor
Редактура: #Золина@inbioreactor #operkfs@inbioreactor
